［前言］石杉碱甲，又名Huperzine A，是我国药学工作者于上世纪八十年代从蕨类药用植物“蛇足草”中发掘出来的具有乙酰胆碱酯酶显著抑制作用的新型化学物质，现已在我国研发成用于治疗老年良性记忆障碍、改善由脑内胆碱 能功能缺陷引起的阿尔茨海默氏症患者的记忆功能，以及缓解重症肌无力等疾病的新药[1，2]。本文记述了石杉碱甲的发现和研究的一些史实，同时也首次报告了一些有关的科学研究数据以及对石杉碱甲结构特征、互变异构体等的阐述。值此母院浙江省医学科学院65周年华诞, 特献此文以示庆贺。
［关键词］蛇足草，千层塔，石杉碱甲，老年性痴呆症，阿尔茨海默氏症，Huperzine A
The facts of the discovery of Huperzine A as a remarkable cholinesterase inhibitor
Chao-Mei Yu
(Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013)
Abstract: Huperzine A, a Lycopodium alkaloid, was discovered from a traditional folk herb Huperzia serrate (Thunb.) Trevis. in the 1980s in China by pharmaceutical scientists at the lab of the Zhejiang Academy of Medicine, and its further studies were carried out by collaboration with the Shanghai Institute of Materia Medica and some clinicians at The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University. Huperzine A exhibits remarkable cholinesterase inhibition, and has now been developed and approved in China as a new drug for the treatment of Alzheimer’s dementia and improvement of senile memory loss as well as for the treatment of myasthenia gravis. This review records historic facts in the discovery of Huperzine A and presents for the first time some new relevant scientific data and discussions.
Key words: Huperzine A, Lycopodium alkaloid, Alzheimer’s disease, senile dementia, memory disorders
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著名乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲的发现，这不仅是中国中草药乃至世界植物药研究的重大成果和成功典范, 同时也是我国在自主知识产权的新药发明史上的骄傲。
作为第一发明人[12] ，作者亲历了石杉碱甲的发现以及其工艺的创建和完善。回忆起这些往事，确实还能令人有些感慨和欣慰，但这还须追溯至上个世纪的七十年代。1966年至1976年，中国经历了一场十年浩劫的文化大革命。广大医药学工作者虽然经受迫害，被迫流放艰苦农村接受“再教育”，却矢志坚持科研和为农村服务，曾与当地村民和乡医一起在全国范围内掀起过一场发掘中草药宝库的运动。1971年，当时的浙江省卫生实验院（现浙江省医学科学院)药物研究所在开展浙江省民间中草药调查和整理中，发现药用植物蛇足草在浙南地区用于治疗跌打损伤，并具有退热、除湿、消瘀、止血等功能[3]。蛇足草,又名千层塔,为石松科植物,其学名经鉴定为Lycopodium serratum Thunb.，后更名为Huperzia serrate(Thunb.)Trevis.[4]。1972年，该院药物所药剂室沈文照同志负责的浙江省蛇足草研究协作组展开了对蛇足草化学成分的研究，首次报道该植物的生物碱在动物实验上显示横纹肌松弛作用。后又经临床试验证明,其有效的化学部位属非酚性强碱性生物碱[5,6]。1975年，上海精神病防治院报道用该草药煎剂治疗精神分裂症有效。1979年4月至1980年2月, 浙江省蛇足草研究协作组用蛇足草中提取的强碱性总生物碱制成的“蛇足草Ⅲ号片”对精神分裂症进行了试治，但此课题最后也就以不甚显著的临床疗效（治疗精神分裂症114例中，显著进步10例，有进步29例，无效者75例)[7]伴随着当时的中草药运动的消声匿迹而终止。
1981年，作者在中科院上海药物所作短期的访问和工作。3月，在沈文照同志的同意下并经当时浙医科院药物所领导的批准，作者被授权对植物蛇足草的生物碱成分开展进一步的研究。经初步研究，从沈馈赠的72克蛇足草非酚性总碱中，首次分得五个结晶性生物碱，其中三个被鉴定，随后与沈等药剂室同事一起具名发表［8］。这期间，作者也与上海药物所药理学家唐希灿建立了协作关系。
1982年，从上海药物所回来的作者重新审视了其对蛇足草活性化学成分的初步研究，认识到该植物含有众多石杉生物碱的复杂性，以及鉴于常规用于生物碱薄层层析检出和柱层析分离的氧化铝吸附剂的不理想分离效果,首次设想和试制了经过自行碱化了的硅胶吸附剂[9]，并经过无数次分离实验，获得了其对石杉生物碱类分离效果上的突破，这为后来的研究成果奠定了很重要的基础。其次是作出了改变研究方向的重要决定，确立了以浙江省蛇足草研究协作组过去不曾重视的酚性生物碱类提取物作为新的成分研究和分离探索的目标。
研究不久, 在送往上海药物所的几个柱层析粗分得到的样品中，发现其中有几份在动物实验中显示了明显的抑制乙酰胆碱酯酶的活性。其后, 又经进一步努力从有活性的流分混合物中分离到了类白色结晶单体,这一天是1982年3月17日。随后，该单体被进一步证明具有显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性[10a]，并择代号为“317”，后命名为"石杉碱甲"。
由于石杉碱甲单体的发现和其显著的生物活性，令人惊喜。上海药物所(唐希灿和朱元龙)立即主动并积极地前来浙医科院药物所洽谈，并签订了浙医科院药物所（甲方）与上海药物所（乙方）对石杉碱甲进行研究的协议。由于协议的签订和较好的研究前景，促进了当时浙医科院和药物所领导的加倍重视和关心, 很快向省科委破例地为当时还是一位实习研究员的作者补报了此课题, 并获得了一些特别经费支持。此后，为开展进一步的动物和临床试验制备足够量的石杉碱甲材料，同时为建立并完善石杉碱甲的生产工艺，当时的伏纬华院长和周有作所长亲自带队和作者乘坐长途汽车，在为修建高速公路而另时开辟的山区泥坑路上经受长达七、八个小时之久的颠簸，奔赴浙南地区以策划草药蛇足草的大量收购事项。在当时台州地区药检所所长李德英的热情协助下，与当地有关部门落实了对草药蛇足草的大量收购工作。这是很重要的一步，它保障了对石杉碱甲作进一步研究的“粮草”。
从草药蛇足草中分离石杉碱甲单体是一个从大量到小量、从粗到精、繁杂和冗长的研制过程。它包括药材的收购和粉碎; 植物成分的乙醇提取和浓缩以获取总植物成分提取物; 总植物成分提取物经酸液捏溶、氨水碱化、氯仿萃取，然后浓缩以获取总生物碱; 总生物碱用强碱溶液萃取、萃取液经酸碱度调节，然后用氯仿萃取以获得酚性生物碱和非酚性生物碱的分离; 大型柱层析用的碱性硅胶的制备; 酚性生物碱的制备性柱层析分离、流分接收、碱性硅胶薄层层析对目标流分检出和合并以获取石杉碱甲粗品; 最后通过重结晶获取石杉碱甲精品。实验中还观察到石杉碱甲在丙酮溶剂的结晶过程中形成二种晶体。
石杉碱甲在结构上不具有酚羟基，它之所以能被用于酚性化合物提取的方法萃取是因为其结构A环的2-吡啶酮在非极性溶液中能形成它的互变异构体2-羟基吡啶，而后者就含具有弱酸性的酚性羟基。这种在溶剂中产生的互变异构现象在1%NaOH溶液中会失去平衡,直接驱使互变平衡中的2-羟基吡啶完全转化成可以在碱液中溶解的2-羟基吡啶钠盐(见下图):
1983年，蛇足草一共收购了464.2公斤,被分成八批次提取分离。其乙醇提取工序是借用了当地药厂设备分批完成的。其中，六批采用了乙醇热回流提取法, 而最后二批采用了乙醇渗漉法。经比较, 渗漉法获得的提取物含较少色素, 但二法的石杉碱甲的得率无明显差异(见下表)。
从乙醇提取的总植物成分中萃取总生物碱的工作是在浙医科院药物所植化室内进行。由于生产批次多且量大, 在蛇足草乙醇提取物经酸液捏溶、碱化后用氯仿萃取总生物碱的步骤中曾用到了容积大至50立升的蒸馏水瓶（具放水下口）作为分液漏斗，通过将其在实验台的铺垫上滚摇进行萃取。也曾记得，那时候实验室无特殊通风设置，由于提取期间对氯仿的长时间接触，竟能让人从实验人员的呼出气中嗅到浓浓的氯仿溶剂味。用毕的氯仿试剂瓶也曾堆积似小山。总碱的萃取工作是在植化室同事韩燕艺、吴凤梧和戚宝凤等同志的协助下一起完成的。随后的酚性生物碱的萃取以及石杉碱甲的制备性柱层析分离是与韩燕艺等同志一起经过数月的艰苦努力完成的。通过七批次的制备全过程，累计获得石杉碱甲48克，平均得率约为9.87×10-5，每克相当于生药量约9.7公斤。循作者设计的生产流程进行如此多批次的实践操练，这为1983年末的石杉碱甲生产工艺的完善和起草提供了宝贵的第一手资料和可靠的科学依据，也为石杉碱甲的化学结构、药理作用、剂型、质量标准制定的进一步研究，以及为后来的重症肌无力和老年性记忆减退患者的临床试治准备了药源。
在石杉碱甲的化学结构的初步鉴定中，作者发现其与文献中报道的石杉生物碱Selagine［11]在熔点、红外特征吸收及分子量诸分面极相似，但是也注意到了二者旋光率达51度的显著差异。由于浙医科院无条件作进一步结构分析, 遂将石杉碱甲和与其同时分得的石杉碱乙(Huperzine B)送交此项研究课题协作单位上海药物所，委托刘嘉森（当时朱元龙已调离该所）协助分析。在核磁共振结构分析中，发现石杉碱甲在环内双键烯碳8位上的质子由于受到邻位叔碳上的质子的隅合呈现双峰, 而文献报导的Selagine结构，其环内双键中含烯氢质子的烯碳是在14位，并且其邻位无质子偶合而应显示单峰。此外，二者的环外双键也呈现相反构形。正因为二者结构具有如此显著的差异性，这也就在根本上彻底地否定了石杉碱甲为已知生物碱Selagine的可能性（石杉碱甲和Selagine 的结构比较见下图)，从而确立了石杉碱甲化学结构的新异性以及在文献中的相应地位。
石杉碱甲和乙及其被制备的一些衍生物连同它们的药理作用曾在1985年申请，1993年曾获得美国专利(#5,177,082) [12]。有关发明人的排列，曾获来信告知:作者“被理所当然地列为了第一发明人”[10b]。(该专利后来由于当时缺乏经验而导致过期。虽此，该专利现仍在美国专利局的资料库中记录在案并可查阅。) 1985年4月25日，浙江省卫生厅召开了鉴定会，对石杉碱甲的化学结构、药理作用、质量标准等进行了讨论并一致通过鉴定。1985年底，被委托者刘则以第一和通讯作者的双重身份发表了石杉碱甲和石杉碱乙的化学结构[13]。1986年12月9日浙江省医学科学院药物研究所和中科院上海药物研究所对石杉碱甲及其注射液的研究获国家卫生部乙级科技奖。1987年浙江省医学科学院药物研究所和中科院上海药物研究所对石杉碱甲及其注射液的研究获浙江省科技成果二等奖(获奖人: 俞超美，唐希灿，刘嘉森和韩燕艺)。之后，在申报国家科研成果时，浙江省医科院药物所和上海药物所所申请的“真性胆碱酯酶抑制剂新药-石杉碱甲”的课题，与中国军事科学院毒物药物研究所从石杉科马尾杉属的华南马尾杉中分离得到并命名为“福定碱”的相同化合物的类似研究课题相遇。1987年9月，浙江省医科院药物所和上海药物所偕同中国军事医学科学院毒物药物研究所对石杉碱甲的新药研究共获中国发明协会第三届全国发明金奖［获奖人：俞超美 (浙江省医科院药物所)，徐择邻 (中国军事科学院)，唐希灿 (中科院上海药物所)，刘嘉森 (中科院上海药物所)，韩燕艺 (浙江省医科院药物所)，赵庆余 (中国军事科学院)，秦伯益 (中国军事科学院)和周有作 (浙江省医科院药物所)][24a]。 数月之后，于1987年12月浙江省医科院药物所和上海药物所又再次偕同中国军事医学科学院毒物药物研究所对石杉碱甲的新药研究共享国家科技发明二等奖。这里值得一提的是，正如此前在接受中国发明协会颁发金奖时由各方认同的获奖人排列顺序之显示，它体现了我方当时不论在石杉碱甲的新化学结构阐明和药理研究重要论文的正式发表方面，还是在临床研究、生产工艺和新药鉴定的通过等诸方面均领先于对方对福定碱研究的不争事实。国际上所有著名文献索引（如美国化学文摘，默克索引，等等）、权威杂志上发表的有关的化学和药理研究论文以及后来2005年版《中国药典》均接纳和肯定了我们为该具有显著乙酰胆碱酯酶抑制作用的生物碱所冠的＂石杉碱甲（Huperzine A）＂之名。尽管如此，双方在获取国家发明奖前夕曾对各方发明人的名额和排列顺序进行了新的协商[25]，最后我方以第一发明人让位给军科院人员的代价换取了多于对方二名发明人的署名权[24b]。
说也凑巧，文献报道的生物碱Selagine 竟是作者的博士生导师 Wiesner 教授(加拿大著名天然产物化学家)和Valenta教授等人于1960年从当地的Lycopodium slago L.中发现，并通过一些化学降解的经典手段和初级的60兆周核磁共振仪的分析解决了它的化学结构。然而，就在石杉碱甲的化学结构闻世三年之后，石杉碱甲和Selagine之间的结构之迷终于被加拿大Alberta大学Ayer教授(Wiesner教授早期学生)的研究小组揭开了: 他们在Alberta省采集了过去分到过Selagine的同一植物并进行了重复研究。借助于现代光谱分析，他们发现从该植物中分离到的Selagine不仅与Wiesner教授实验室里过去29年前唯一幸存的、曾用于红外光谱分析的溴化钾压片中的Selagine样品(由二氯甲烷从中萃取而得)一致，而且也与石杉碱甲的结构吻合。同时，他们也证明台湾学者报道的石杉生物碱Isoselagine[14]也与石杉碱甲同属一物[15]。平心而论，凭着早年的实验条件，能如此推解出仅与石杉碱甲双键位置和构向不同的Selagine分子骨架已属不易。所报道的旋光度不同也被推测是当年参与的博士后人员由于仪器用前校准不当或测定疏忽等因素所致[16]。
药用植物蛇足草的化学成分研究以及其有效成分石杉碱甲的发现是浙江省医科院先前历史性研究课题的继续和成果，中科院上海药物所是参与研究的协作单位。著名的乙酰胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲的发明距今已三十多年过去了，不但很多事情都已被人淡忘，文献引用也出现了许多混乱和讹传[23]。有单位宣传说，石杉碱甲的发现是“某药物所某药物学家在临床调查中发现，中草药蛇足石杉具有非常独特的作用”。又有某大学药物化学教研室在网上发表的教学幻灯片称道：抗老年性痴呆药石杉甲是“上世纪70年代，某药物所某人在浙江西部山区的一次野外调查中发现一种民间治疗跌打损伤的草药蛇足石杉，对此种草药的进一步研究中他们发现了一种结构新颖的胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲”。在此，作者可以负责任地说，这些都是没有丝毫事实根据的，全是由臆想而编织出来的美丽故事。此外，也很少有人知晓，在报告石杉碱甲和石杉碱乙的发现和结构分析的主要论文[13]的署名中，谁才应该是按常理的第一作者。更没有人会相信，某药物所曾摒弃浙江医学科学院独自申请并获得与石杉碱甲研究直接有关的2000年度国家自然科学二等奖[22]。这些，除了让人叹息外，也让人觉得有必要将那些自己经历过的研究史实写出来。事实毕竟是事实，所有的科学人都应该有坚持真相和直面事实的勇气。
石杉碱甲，由于其化学结构的特异性，它对乙酰胆碱酯酶抑制作用的高效、高度选择和可逆性，以及它在当代医学难题老年性痴呆症展示的显著疗效，引起了国内外药学研究者们的极大兴趣，并掀起对它的研究热潮，由此发表的论文至今仍层出不穷。近年来的研究还证明，通过对抗β-淀粉样蛋白(一种被认为与早老性痴呆症致病有关的物质)产生的氧化应激毒性、调控神经细胞凋亡和促进神经生长因子生长等作用，石杉碱甲还具有保护神经细胞的作用[17]。这些，给人的启示是石杉碱甲对早老性痴呆病变不光有抑制还有改善的双重功效。至于在化学研究方面,化学家们对石杉碱甲的化学结构进行了包括全合成、结构简化、衍生物制备等种种研究[18]。1989年，美国匹兹堡大学化学和行为神经科学系Kozikowski等率先报道了对石杉碱甲的全合成成功[19]。其后，他又与药理研究的有关人员一起对其构-效关系作出了一些研究。他们认为，具有手性碳7-位和13-位的R-构形的天然石杉碱甲分子，在与乙酰胆碱脂酶作用中，要比从化学合成中形成的消旋混合物中分离到的石杉碱甲的光学对映体有更好的立体选择性和结合性[20]。这样有效的结合形式似乎也印证了石杉碱甲对乙酰胆碱脂酶的抑制所具有的显著性和专一性。1999年，美国FDA根据中国现有的药理和临床研究报告文献批准了石杉碱甲在美国作为食品添加剂的使用[21]。其后，由其制成的旨在提高记忆功能的保健品广销于美国各大城市。截至2000年，据报道上海药物所朱大元等又从该科植物中共分得了60多个生物碱，并对石杉碱甲的结构进行了化学修饰，还从中发现了乙酰胆碱酯酶抑制作用显著的衍生物希普林(ZT-1)，现正在将其开发成新一代的乙酰胆碱酯酶抑制剂[22]。
综观石杉碱甲的研究进展，作者充分相信，随着它在阿尔茨海默氏症患者治疗中的进一步应用和更深入的药理研究，它将会继续促进人类对此疾病更深刻的了解，因而也将进一步为攻克这一人类顽疾的新合成药设计提供新的思路和开辟更完美的研制途径。（完稿日期: 2015年4月）
编后语：俞超美博士以浙江省医学科学院为研究单位又于2014年3月，在加拿大国家科学院的《加拿大化学学报》上发表了又一个具有新型化学结构的石杉生物碱(Huperzimine)的论文[9]。这不仅从老一辈科研工作者身上映衬出孜孜不倦的敬业精神，也为他在省医科院从事草药蛇足草的石杉生物碱的研究画上了一个圆满的句号。
【作者简介】:
俞超美（e-mail:chaomei.yu@gmail.com)，博士，现为加拿大联邦卫生部FDA 资深药物评审顾问。1976年至1985年为浙江省医学科学院药物所植化室实习研究员；1985年2月赴加拿大New Brunswick大学留学，于1989年获有机化学博士；1990年至1996年于加拿大国家海洋研究所从事海洋生物和真菌代谢产物的有效成分研究；1997年受聘于加拿大联邦卫生部药品质量评审局；1999年被授予浙江省医学科学院客座研究员；2005年获选美国药典专家委员会成员。
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（备注：编辑配图，图片来自互联网）
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